Zespół naukowców pod kierownictwem dr Jolanty Małajowicz z Katedry Chemii Instytutu Nauk o Żywności SGGW w swojej pracy badawczej podejmuje próby biotechnologicznej syntezy związków z tzw. „zielonej nuty zapachowej” kojarzonych m.in. z aromatem zielonych jabłek, melonów, ogórków czy świeżo ściętej trawy. Biotechnologiczna produkcja staje się coraz popularniejsza ze względu na swoją proekologiczność. Czy uda się nią zastąpić tradycyjne metody produkcji, chemiczne i obciążające środowisko?

Zapotrzebowanie na aromaty

Powszechnie wiadomo, że stosowanie związków zapachowych zwiększa atrakcyjność sensoryczną produktów, zarówno spożywczych, jak i kosmetycznych, przez co stają się bardziej akceptowalne i pożądane. Dla technologów żywności w przemyśle spożywczym aromaty stanowią jedną z kluczowych grup dodatków do żywności, ponieważ stabilizują właściwości sensoryczne tych produktów, które na przykład ze względu na niekorzystne warunki klimatyczne czy też długotrwałe przechowywanie, a także obróbkę technologiczną straciły w pewnym stopniu swój naturalny aromat i smak. W ostatnich latach z uwagi na wzrost zainteresowania społeczeństwa problemami ekologicznymi obserwuje się trend wyboru metod wytwarzania aromatów w sposób przyjazny środowisku. I to stanowi impuls dla rozwoju rynku zapachów pochodzenia biotechnologicznego.

Grupę związków zielonej nuty zapachowej stanowią krótkołańcuchowe C6, C9 aldehydy, takie jak: heksanal, heksenal, nonenal, nonadienal oraz odpowiadające im alkohole: heksenol czy nonadienol. Substancje te są w naturalny sposób syntetyzowane w roślinach za pośrednictwem dwóch kluczowych enzymów - lipooksygenazy i liazy wodoronadtlenkowej. Lipooksygenaza katalizuje reakcje utleniania kwasów nienasyconych (w tym m.in. kwasu linolowego i linolenowego) do wodoronadtlenków, które stanowią substraty działania kolejnych enzymów, w tym liazy wodoronadtlenkowej czy izomeraz. Aktywność tych enzymów prowadzi w efekcie końcowym do powstawania związków odpowiedzialnych m.in. za przyjemny, charakterystyczny i pożądany w wielu produktach spożywczych czy kosmetycznych aromat.

Pozyskiwanie związków zapachowych z naturalnych źródeł przy wykorzystaniu ekstrakcji jest ograniczone, gdyż istotne sensorycznie składniki roślin potrzebne do uzyskania określonego aromatu występują bardzo często w niewielkich ilościach. Stąd też ich izolacja, a później otrzymanie w odpowiednio dużym stężeniu są z reguły kosztowne. Ponadto niestandardowość materiału roślinnego też ma znaczenie. W przypadku różnych warunków środowiskowych czy chorób roślin substancje zapachowe mogą generować się w mniejszych ilościach.

- Dlatego też przyjazną środowisku metodą, alternatywną względem ekstrakcji (izolacji) z naturalnych źródeł, jest synteza związków de novo z wykorzystaniem mikroorganizmów lub biotransformacja, czyli synteza z surowców naturalnych w reakcjach katalizowanych przez enzymy - mówi dr Jolanta Małajowicz z SGGW. - Biotransformacje polegające na przekształcaniu związków chemicznych pod wpływem enzymów, stanowią ważną i dynamicznie rozwijającą się dziedzinę chemii organicznej, ponieważ dzięki tej technice można przeprowadzać przemiany związków organicznych z selektywnością rzadko osiąganą innymi metodami. Można je prowadzić przy udziale wolnych enzymów, jak też zawierających je komórek czy tkanek, które spełniają rolę biokatalizatora. Uwzględniając rosnące zapotrzebowanie rynku na bioaromaty, zdecydowaliśmy się w Katedrze Chemii podjąć badania nad biotechnologiczną syntezą związków z grupy zielonej nuty zapachowej, bazujące na reakcjach biotransformacji kwasów tłuszczowych, prowadzonych za pośrednictwem mikroorganizmów.

 

Mikroorganizmy Yarrowia lipolytica

Do biotechnologicznej syntezy związków z zielonej nuty zapachowej grupa naukowców z SGGW zdecydowała się użyć mikroorganizmów - drożdży o nazwie Yarrowia lipolytica. Dlaczego akurat tych?

- Pracujemy nad tymi drożdżami w zespole już wiele lat i trochę o nich wiemy - wyjaśnia dr J. Małajowicz z Katedry Chemii. - Między innymi wykorzystywałam je w swojej pracy doktorskiej, w syntezie estrów, więc znane nam są ich optymalne warunki środowiskowe, niezbędne w prawidłowym namnażaniu i sekrecji pożądanych enzymów. Za wyborem tych drożdży przemawiał także fakt ich stabilności taksonomicznej, ponadto są niepatogenne. Posiadają status GRAS (Generally Recognized As Safe) - jest to status określany przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration - FDA), są więc dopuszczone do kontaktu z żywnością. Te cechy m.in. zadecydowały o wykorzystaniu ich w syntezie wyżej wspomnianych związków zapachowych.

Aktualnie, naukowcy z SGGW współpracują z genetykami z Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk, by przeprowadzić efektywną modyfikację dzikiego szczepu drożdży Yarrowia lipolytica pod kątem ekspresji dwóch roślinnych białek enzymatycznych: lipooksygenazy (LOX) oraz liazy wodoronadtlenkowej (HPL). Przeprowadzono modyfikację drożdży metodą rekombinacji DNA. Ekspresja heterologicznego białka opierała się na czterech podstawowych etapach: klonowaniu sekwencji roślinnego DNA kodującego białka LOX i HPL, konstrukcji wektora plazmidowego niosącego cDNA białek enzymatycznych, transformacji komórek gospodarza (szczepu Yarrowia lipolytica) odpowiednio skonstruowanym wektorem, a następnie izolacji i selekcji mutantów.

- Teraz trwają badania nad oceną poziomu ekspresji genów heterologicznych białek LOX i HPL w komórkach drożdży, które wykazują pobranie plazmidu do wnętrza komórki - tłumaczy dr Jolanta Małajowicz. - Właściwy poziom aktywności katalitycznej szczepu drożdży Yarrowia pozwoli nam w kolejnym etapie prac badawczych przeprowadzić doświadczenia z kulturą rosnącą, dla której w modelowych reakcjach, z zastosowaniem jako substratów kwasu linolowego lub linolenowego oraz ich wodoronadtlenków, dokonamy oceny aktywności kluczowych, z punktu widzenia syntezy zielonych aromatów, enzymów. Dopiero wówczas będziemy w stanie sprawdzić, z jaką wydajnością modyfikowany biokatalizator transformuje kwasy tłuszczowe.

 

Biotechnologiczna przyszłość

Przed naukowcami jeszcze wiele pracy. Po zakończonych sukcesem badaniach genetyków, biotechnolodzy z SGGW będą mogli przejść do kolejnego etapu. Będą testować aktywność katalityczną modyfikowanych drożdży Yarrowia lipolytica w różnych podłożach, w tym z dodatkiem odpadowych substancji tłuszczowych, aby wypracować najbardziej optymalne, pod względem ekologicznym i ekonomicznym, warunki do syntezy związków zielonej nuty zapachowej.

Aktualnie zapachy powstają w głównej mierze na bazie reakcji chemicznych, przy użyciu szeregu rozpuszczalników organicznych, które są toksyczne dla środowiska. Stąd wydajna produkcja aromatów za pośrednictwem metod biotechnologicznych, bez obciążania środowiska, niezależna od warunków środowiskowych oraz przy maksymalnym zmniejszeniu kosztów w stosunku do obecnych metod jest teraz priorytetem.